Bài 6. Thực hành: Tách chiết DNA – Tóm tắt Sinh học 12

1. Nguyên lý tách chiết DNA

Ở tế bào nhân thực, DNA nằm chủ yếu trong nhân, được bao bọc bởi màng sinh chất và màng nhân. Để tách chiết được DNA, cần phá vỡ các màng này để giải phóng DNA, đồng thời bảo vệ DNA khỏi bị phân hủy bởi enzyme trong tế bào, rồi thu DNA về trạng thái kết tủa.

Bốn giai đoạn chính

Phá vỡ tế bào: dùng chất tẩy rửa hòa tan lớp phospholipid kép và protein màng, mở ra vùng chứa DNA.
Bảo vệ DNA: dùng dung dịch đệm pH ổn định và chất ức chế enzyme nuclease, ngăn DNA bị cắt đứt.
Hòa tan và tách tạp chất: ion $\mathrm{Na^{+}}$ trung hòa điện tích âm trên nhóm phosphate của DNA, giúp DNA tan trong dịch; mảnh vỡ tế bào được loại bằng lọc; protein (kể cả histone gắn với DNA) được phân giải bằng enzyme protease (ví dụ có trong nước ép dứa).
Kết tủa DNA: ethanol lạnh làm DNA kết tủa thành sợi trắng đục, dễ thu nhặt.

2. Vai trò của các chất trong dung dịch tách chiết

Bảng thành phần và chức năng

Thành phần	Vai trò	Cơ chế chính
Nước rửa chén (detergent)	Phá vỡ màng sinh chất và màng nhân	Hòa tan phospholipid và protein màng
Muối ăn $\mathrm{NaCl}$	Tăng khả năng tan của DNA	Ion $\mathrm{Na^{+}}$ trung hòa điện tích âm của nhóm phosphate
Nước ép dứa (enzyme protease)	Loại bỏ protein	Phân giải protein, tách protein khỏi DNA
EDTA (trong phòng thí nghiệm)	Ức chế enzyme nuclease	Liên kết ion $\mathrm{Mg^{2+}}$ cần cho enzyme nuclease hoạt động
Dung dịch đệm Tris (trong phòng thí nghiệm)	Bảo vệ DNA	Ổn định pH cho môi trường ly giải
Ethanol lạnh	Kết tủa DNA	DNA không tan trong ethanol nên kết tủa

3. Quy trình thực hành

Các bước tách chiết DNA từ mô sinh vật

1.
Chuẩn bị mẫu: chọn mô giàu nhân, non mềm như lá cây non, gan lợn đã rã đông. Rửa sạch, cắt nhỏ.
2.
Ly giải tế bào: cho mẫu vào cối, thêm dung dịch tách chiết, nghiền hoặc xay nhuyễn cho đến khi được dịch đồng nhất.
3.
Loại bỏ tạp chất: lọc dịch nghiền qua vải hoặc giấy lọc để loại mảnh vỡ mô; có thể thêm nước ép dứa để phân giải protein.
4.
Kết tủa DNA: từ từ đổ ethanol lạnh theo thành ống nghiệm đựng dịch chiết, đặt ống thẳng đứng và để yên.
5.
Thu DNA: dùng que thuỷ tinh hoặc que tre nhẹ nhàng quấn lấy các sợi DNA trắng đục xuất hiện ở ranh giới hai lớp dịch.
6.
Quan sát: quan sát màu sắc, hình dạng sợi DNA và ghi nhận kết quả.

Lưu ý

Ethanol cần được để lạnh trước khi sử dụng. Ethanol lạnh làm DNA kết tủa tốt hơn và hạn chế hoạt động của enzyme phân giải DNA.
Rót ethanol nhẹ nhàng theo thành ống, không lắc mạnh để sợi DNA không bị đứt gãy.
Mẫu mô nên xử lí nhanh, ở nhiệt độ thấp để hạn chế enzyme nuclease phân hủy DNA.

4. Ý nghĩa và ứng dụng

Bài thực hành giúp học sinh hình thành kĩ năng tách chiết đại phân tử sinh học, hiểu rõ vai trò của các thành phần trong dung dịch ly giải và ý nghĩa của việc kiểm soát pH, ion, nhiệt độ. Mẫu DNA thu được có thể được dùng cho các thí nghiệm tiếp theo như khuếch đại DNA bằng PCR, cắt bằng enzyme giới hạn hoặc điện di.

5. Ví dụ minh hoạ

Ví dụ 1

Tại sao khi thêm ethanol lạnh vào dịch chiết, ta thu được sợi DNA trắng đục bay lơ lửng ở ranh giới hai chất lỏng?

Lời giải

DNA tan trong dịch chiết (nước) nhưng không tan trong ethanol. Ethanol nhẹ hơn nước nên tạo thành lớp nằm trên dịch chiết. Tại ranh giới hai lớp, khi gặp ethanol lạnh, các phân tử DNA (đã được ion $\mathrm{Na^{+}}$ trung hoà điện tích âm) mất lớp nước bao quanh, kết tụ với nhau thành sợi trắng đục và nổi lên ở ranh giới, đi vào lớp ethanol.

6. Câu hỏi vận dụng

Câu hỏi 1

Trong quá trình tách chiết DNA, nếu bỏ qua bước thêm EDTA nhưng vẫn dùng đầy đủ nước rửa chén, muối ăn và ethanol lạnh, thì chất lượng DNA thu được có bị ảnh hưởng không? Giải thích.

Gợi ý trả lời

Có. Nếu thiếu EDTA, enzyme nuclease trong tế bào vẫn hoạt động mạnh, cắt đứt phân tử DNA thành những đoạn ngắn. Kết quả thu được sẽ là các đoạn DNA rời rạc hoặc sợi DNA ngắn, dễ vỡ, không còn nguyên vẹn để sử dụng cho các thí nghiệm về sau.